Javascript jest aktualnie wyłączony w Twojej przeglądarce.Gdy JavaScript jest wyłączony, niektóre funkcje tej witryny nie będą działać.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Katalonia, Hiszpania * Autorzy mają pewne spostrzeżenia na temat tej pracy. tło wkładu: Kwas hialuronowy (HA) jest naturalnie występującym polisacharydem stosowanym w produkcji wypełniaczy skóry w celach estetycznych.Ponieważ w ludzkich tkankach ma okres półtrwania wynoszący kilka dni, wypełniacze skórne na bazie HA są modyfikowane chemicznie, aby przedłużyć ich żywotność w organizmie.Najczęstszą modyfikacją w komercyjnych wypełniaczach na bazie HA jest zastosowanie eteru diglicydylowego 1,4-butanodiolu (BDDE) jako środka sieciującego do sieciowania łańcuchów HA.Pozostały lub nieprzereagowany BDDE jest uważany za nietoksyczny w stężeniu <2 części na milion (ppm);dlatego, aby zapewnić bezpieczeństwo pacjenta, należy określić ilościowo pozostałości BDDE w końcowym wypełniaczu skórnym.Materiały i metody: W pracy opisano wykrywanie i charakterystykę produktu ubocznego reakcji sieciowania pomiędzy BDDE i HA w warunkach alkalicznych poprzez połączenie chromatografii cieczowej i spektrometrii masowej (LC-MS).Wyniki: Po różnych analizach stwierdzono, że warunki alkaliczne i wysoka temperatura stosowane do dezynfekcji hydrożelu HA-BDDE sprzyjały powstawaniu nowego produktu ubocznego, związku „glikolu propylenowego”.Analiza LC-MS potwierdziła, że produkt uboczny ma taką samą masę monoizotopową jak BDDE, inny czas retencji (tR) i inny tryb absorbancji UV (λ=200 nm).W przeciwieństwie do BDDE zaobserwowano w analizie LC-MS, że w tych samych warunkach pomiarowych ten produkt uboczny ma wyższą szybkość wykrywania przy 200 nm.Wnioski: Wyniki te wskazują, że w strukturze tego nowego związku nie ma epoksydu.Dyskusja jest otwarta na ocenę ryzyka tego nowego produktu ubocznego występującego w produkcji hydrożelu HA-BDDE (wypełniacz skóry HA) do celów komercyjnych.Słowa kluczowe: kwas hialuronowy, wypełniacz skórny HA, usieciowany kwas hialuronowy, BDDE, analiza LC-MS, produkt uboczny BDDE.
Wypełniacze na bazie kwasu hialuronowego (HA) to najpopularniejsze i najbardziej popularne wypełniacze skórne stosowane w celach kosmetycznych.1 Ten wypełniacz skórny jest hydrożelem, zwykle składającym się z >95% wody i 0,5-3% HA, co nadaje im strukturę podobną do żelu.2 HA jest polisacharydem i głównym składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej kręgowców.Jeden ze składników.Składa się z powtarzających się jednostek disacharydowych kwasu (1,4)-glukuronowego-β (1,3)-N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) połączonych wiązaniami glikozydowymi.Ten wzór disacharydowy jest taki sam we wszystkich organizmach.W porównaniu z niektórymi wypełniaczami na bazie białka (takimi jak kolagen), ta właściwość sprawia, że HA jest wysoce biokompatybilną cząsteczką.Te wypełniacze mogą wykazywać specyficzność sekwencji aminokwasów, która może być rozpoznawana przez układ odpornościowy pacjenta.
Gdy jest stosowany jako wypełniacz skórny, głównym ograniczeniem HA jest jego szybki obrót w tkankach ze względu na obecność specyficznej rodziny enzymów zwanych hialuronidazami.Jak dotąd opisano kilka modyfikacji chemicznych w strukturze HA w celu wydłużenia okresu półtrwania HA w tkankach.3 Większość z tych modyfikacji ma na celu zmniejszenie dostępu hialuronidazy do polimerów polisacharydowych poprzez sieciowanie łańcuchów HA.Dlatego też, ze względu na tworzenie mostków i międzycząsteczkowych wiązań kowalencyjnych między strukturą HA a środkiem sieciującym, usieciowany hydrożel HA wytwarza więcej produktów degradacji antyenzymatycznej niż naturalny HA.4-6
Jak dotąd chemiczne środki sieciujące stosowane do produkcji usieciowanego HA obejmują metakrylamid, 7 hydrazyd, 8 karbodiimid, 9 diwinylosulfon, eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu (BDDE) i eter diglicydylowy glikolu polietylenowego.10,11 BDDE jest obecnie najczęściej stosowanym środkiem sieciującym.Chociaż od dziesięcioleci udowodniono, że tego typu hydrożele są bezpieczne, stosowane środki sieciujące są reaktywnymi odczynnikami, które mogą być cytotoksyczne, aw niektórych przypadkach mutagenne.12 Dlatego ich resztkowa zawartość w końcowym hydrożelu musi być wysoka.BDDE jest uważany za bezpieczny, gdy stężenie resztkowe jest mniejsze niż 2 części na milion (ppm).4
Istnieje kilka metod wykrywania stężenia BDDE o niskiej zawartości pozostałości, stopnia usieciowania i pozycji podstawienia w hydrożelach HA, takich jak chromatografia gazowa, chromatografia wykluczania sprzężona ze spektrometrią mas (MS), metody pomiaru fluorescencji magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) oraz Matryca diodowa sprzężona z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC).13-17 Niniejsze badanie opisuje wykrywanie i charakterystykę produktu ubocznego w końcowym usieciowanym hydrożelu HA wytworzonym w reakcji BDDE i HA w warunkach alkalicznych.HPLC i chromatografia cieczowa-spektrometria mas (analiza LC-MS).Ponieważ toksyczność tego produktu ubocznego BDDE jest nieznana, zalecamy oznaczenie ilościowe jego pozostałości w podobny sposób do metody zwykle wykonywanej na BDDE w produkcie końcowym.
Otrzymana sól sodowa HA (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japonia) ma masę cząsteczkową ~1368000 Da (metoda Laurenta)18 i lepkość istotną 2,20 m3/kg.Do reakcji sieciowania BDDE (≥95%) zakupiono z Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).Sól fizjologiczną buforowaną fosforanem o pH 7,4 zakupiono z Sigma-Aldrich Company.Wszystkie rozpuszczalniki, acetonitryl i wodę użyte w analizie LC-MS zakupiono z jakości HPLC.Kwas mrówkowy (98%) zakupiono jako odczynnik.
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na systemie UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, USA) i połączono z potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym API 3000 wyposażonym w źródło jonizacji przez elektrorozpylanie (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Syntezę usieciowanych hydrożeli HA rozpoczęto przez dodanie 198 mg BDDE do 10% (wag./wag.) roztworu hialuronianu sodu (NaHA) w obecności 1% zasady (wodorotlenek sodu, NaOH).Końcowe stężenie BDDE w mieszaninie reakcyjnej wynosiło 9,9 mg/ml (0,049 mM).Następnie mieszaninę reakcyjną dokładnie wymieszano i homogenizowano, a następnie pozostawiono do działania w 45°C przez 4 godziny.19 pH mieszaniny reakcyjnej jest utrzymywane na poziomie ~12.
Następnie mieszaninę reakcyjną przemyto wodą, a końcowy hydrożel HA-BDDE przesączono i rozcieńczono buforem PBS do uzyskania stężenia HA od 10 do 25 mg/ml i końcowego pH 7,4.W celu sterylizacji wytworzonych usieciowanych hydrożeli HA, wszystkie te hydrożele są autoklawowane (120°C przez 20 minut).Oczyszczony hydrożel BDDE-HA przechowuje się w 4°C do czasu analizy.
W celu analizy BDDE obecnego w usieciowanym produkcie HA, zważono 240 mg próbkę i wprowadzono do środkowego otworu (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; objętość 0,5 ml) i odwirowano przy 10 000 obr./min w temperaturze pokojowej 10 minut.Łącznie zebrano i przeanalizowano 20 µl cieczy do wyciągania.
W celu analizy standardu BDDE (Sigma-Aldrich Co) w warunkach alkalicznych (1%, 0,1% i 0,01% NaOH), jeśli spełnione są następujące warunki, próbka ciekła ma 1:10, 1:100 lub do 1:1 000 000 W razie potrzeby do analizy użyj wody dejonizowanej MilliQ.
W przypadku materiałów wyjściowych stosowanych w reakcji sieciowania (HA 2%, H2O, 1% NaOH i 0,049 mM BDDE), 1 ml każdej próbki przygotowanej z tych materiałów analizowano stosując te same warunki analizy.
W celu określenia specyficzności pików pojawiających się na mapie jonowej, do próbki 20 µl dodano 10 µl standardowego roztworu BDDE o 100 ppb (Sigma-Aldrich Co).W tym przypadku końcowe stężenie standardu w każdej próbce wynosi 37 ppb.
Najpierw przygotuj roztwór podstawowy BDDE o stężeniu 11 000 mg/l (11 000 ppm) przez rozcieńczenie 10 μl standardowego BDDE (Sigma-Aldrich Co) w 990 μl wody MilliQ (gęstość 1,1 g/ml).Użyj tego roztworu do przygotowania roztworu BDDE o stężeniu 110 µg/L (110 ppb) jako pośredniego standardowego rozcieńczenia.Następnie użyj pośredniego standardowego rozcieńczalnika BDDE (110 ppb), aby przygotować krzywą standardową poprzez kilkukrotne rozcieńczenie pośredniego rozcieńczalnika do uzyskania pożądanego stężenia 75, 50, 25, 10 i 1 ppb.Jak pokazano na rysunku 1, stwierdzono, że krzywa standardowa BDDE od 1,1 do 110 ppb ma dobrą liniowość (R2>0,99).Krzywą standardową powtórzono w czterech niezależnych eksperymentach.
Rysunek 1 Standardowa krzywa kalibracji BDDE uzyskana za pomocą analizy LC-MS, w której obserwuje się dobrą korelację (R2>0,99).
Skróty: BDDE, eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu;LC-MS, chromatografia cieczowa i spektrometria mas.
W celu identyfikacji i ilościowego określenia standardów BDDE obecnych w usieciowanych standardach HA i BDDE w roztworze podstawowym zastosowano analizę LC-MS.
Rozdział chromatograficzny uzyskano na kolumnie LUNA 2,5 µm C18(2)-HST (50x2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) i utrzymywano w temperaturze pokojowej (25°C) podczas analizy.Faza ruchoma składa się z acetonitrylu (rozpuszczalnik A) i wody (rozpuszczalnik B) zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego.Faza ruchoma jest eluowana przez elucję gradientową.Gradient jest następujący: 0 minut, 2% A;1 minuta, 2% A;6 minut, 98% A;7 minut, 98% A;7,1 minuty, 2% A;10 minut, 2% A. Czas działania wynosi 10 minut, a objętość wtrysku wynosi 20 µl.Czas retencji BDDE wynosi około 3,48 minuty (w zakresie od 3,43 do 4,14 minuty na podstawie eksperymentów).Fazę ruchomą pompowano z szybkością przepływu 0,25 ml/min do analizy LC-MS.
Do analizy BDDE i oznaczenia ilościowego za pomocą MS, system UPLC (Waters) jest połączony z potrójnym kwadrupolowym spektrometrem mas API 3000 (AB SCIEX) wyposażonym w źródło jonizacji elektrorozpylania, a analizę przeprowadza się w trybie jonów dodatnich (ESI+).
Zgodnie z analizą fragmentów jonów przeprowadzoną na BDDE, fragment o największej intensywności określono jako fragment odpowiadający 129,1 Da (Figura 6).Dlatego też w trybie monitorowania wielojonowego (MIM) do kwantyfikacji konwersja masy (stosunek masy do ładunku [m/z]) BDDE wynosi 203,3/129,1 Da.Wykorzystuje również tryb pełnego skanowania (FS) i tryb skanowania jonów produktu (PIS) do analizy LC-MS.
W celu weryfikacji specyficzności metody analizowano próbkę ślepą (początkowa faza ruchoma).Nie wykryto sygnału w ślepej próbce z konwersją masy 203,3/129,1 Da.Odnośnie powtarzalności eksperymentu, przeanalizowano 10 standardowych nastrzyków 55 ppb (w środku krzywej kalibracyjnej), co dało resztkowe odchylenie standardowe (RSD) <5% (dane nie pokazane).
Resztkową zawartość BDDE oznaczono ilościowo w ośmiu różnych autoklawowanych, usieciowanych hydrożelach HA BDDE, odpowiadających czterem niezależnym eksperymentom.Jak opisano w sekcji „Materiały i metody”, kwantyfikacja jest oceniana przez średnią wartość krzywej regresji rozcieńczenia standardu BDDE, która odpowiada unikalnemu pikowi wykrytemu przy przejściu masy BDDE 203,3/129,1 Da, z retencją czas od 3,43 do 4,14 minut Nie czekam.Figura 2 przedstawia przykładowy chromatogram wzorca odniesienia BDDE o wielkości 10 ppb.Tabela 1 podsumowuje resztkową zawartość BDDE w ośmiu różnych hydrożelach.Zakres wartości wynosi od 1 do 2,46 ppb.Dlatego resztkowe stężenie BDDE w próbce jest dopuszczalne do stosowania u ludzi (<2 ppm).
Figura 2 Chromatogram jonowy 10 ppb wzorca odniesienia BDDE (Sigma-Aldrich Co), przejście MS (m/z) uzyskane przez analizę LC-MS 203,30/129,10 Da (w trybie dodatnim MRM).
Skróty: BDDE, eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu;LC-MS, chromatografia cieczowa i spektrometria masowa;MRM, monitorowanie wielu reakcji;MS, masa;m/z, stosunek masy do ładunku.
Uwaga: Próbki 1-8 to autoklawowane hydrożele HA usieciowane BDDE.Podano również resztkową ilość BDDE w hydrożelu i szczyt czasu retencji BDDE.Na koniec doniesiono również o istnieniu nowych pików o różnych czasach retencji.
Skróty: BDDE, eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu;HA, kwas hialuronowy;MRM, monitorowanie wielu reakcji;tR, czas retencji;LC-MS, chromatografia cieczowa i spektrometria masowa;RRT, względny czas retencji.
Nieoczekiwanie, analiza chromatogramu jonowego LC-MS wykazała, że w oparciu o wszystkie analizowane próbki autoklawowanego, usieciowanego hydrożelu HA, wystąpił dodatkowy pik przy krótszym czasie retencji wynoszącym 2,73 do 3,29 minuty.Na przykład, Rysunek 3 przedstawia chromatogram jonowy usieciowanej próbki HA, gdzie dodatkowy pik pojawia się przy różnym czasie retencji wynoszącym około 2,71 minuty.Zaobserwowany względny czas retencji (RRT) między nowo zaobserwowanym pikiem a pikiem z BDDE wyniósł 0,79 (Tabela 1).Ponieważ wiemy, że nowo zaobserwowany pik jest mniej zatrzymywany w kolumnie C18 stosowanej w analizie LC-MS, nowy pik może odpowiadać związkowi bardziej polarnemu niż BDDE.
Figura 3 Chromatogram jonowy usieciowanej próbki hydrożelu HA otrzymanej metodą LC-MS (konwersja masy MRM 203,3/129,0 Da).
Skróty: HA, kwas hialuronowy;LC-MS, chromatografia cieczowa i spektrometria masowa;MRM, monitorowanie wielu reakcji;RRT, względny czas retencji;tR, czas retencji.
Aby wykluczyć możliwość, że nowe obserwowane piki mogą być zanieczyszczeniami pierwotnie obecnymi w użytych surowcach, surowce te były również analizowane przy użyciu tej samej metody analizy LC-MS.Analizowane materiały wyjściowe obejmują wodę, 2% NaHA w wodzie, 1% NaOH w wodzie i BDDE w tym samym stężeniu, co w reakcji sieciowania.Chromatogram jonowy użytego materiału wyjściowego nie wykazał żadnego związku ani piku, a jego czas retencji odpowiada nowemu zaobserwowanemu pikowi.Fakt ten odrzuca ideę, że nie tylko materiał wyjściowy może zawierać jakiekolwiek związki lub substancje, które mogą zakłócać procedurę analizy, ale nie ma oznak możliwego zanieczyszczenia krzyżowego innymi produktami laboratoryjnymi.Wartości stężeń uzyskane po analizie LC-MS BDDE i nowe piki przedstawiono w Tabeli 2 (próbki 1-4), a chromatogram jonowy na Rysunku 4.
Uwaga: Próbki 1-4 odpowiadają surowcom użytym do produkcji autoklawowanych hydrożeli HA usieciowanych BDDE.Próbki te nie były autoklawowane.
Skróty: BDDE, eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu;HA, kwas hialuronowy;LC-MS, chromatografia cieczowa i spektrometria masowa;MRM, monitorowanie wielu reakcji.
Rysunek 4 odpowiada chromatogramowi LC-MS próbki surowca użytego w reakcji sieciowania HA i BDDE.
Uwaga: Wszystkie z nich są mierzone w tym samym stężeniu i proporcji, jakie zastosowano do przeprowadzenia reakcji sieciowania.Liczby dla surowców analizowanych na chromatogramie odpowiadają: (1) wodzie, (2) 2% wodny roztwór HA, (3) 1% wodny roztwór NaOH.Analizę LC-MS przeprowadza się dla konwersji masy 203,30/129,10 Da (w trybie dodatnim MRM).
Skróty: BDDE, eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu;HA, kwas hialuronowy;LC-MS, chromatografia cieczowa i spektrometria masowa;MRM, monitorowanie wielu reakcji.
Zbadano warunki, które doprowadziły do powstania nowych szczytów.W celu zbadania, w jaki sposób warunki reakcji zastosowane do wytworzenia usieciowanego hydrożelu HA wpływają na reaktywność środka sieciującego BDDE, prowadząc do powstania nowych pików (możliwych produktów ubocznych), przeprowadzono różne pomiary.W tych oznaczeniach zbadaliśmy i przeanalizowaliśmy końcowy środek sieciujący BDDE, który poddano działaniu różnych stężeń NaOH (0%, 1%, 0,1% i 0,01%) w środowisku wodnym, a następnie autoklawowaniu lub bez autoklawowania.Procedura bakteryjna symulująca te same warunki jest taka sama jak metoda stosowana do wytwarzania usieciowanego hydrożelu HA.Jak opisano w części „Materiały i metody”, przejście masy próbki analizowano metodą LC-MS do 203,30/129,10 Da.Oblicza się BDDE i stężenie nowego piku, a wyniki przedstawiono w Tabeli 3. Nie wykryto nowych pików w próbkach, które nie były autoklawowane, niezależnie od obecności NaOH w roztworze (próbki 1-4, Tabela 3).W przypadku próbek autoklawowanych nowe piki są wykrywane tylko w obecności NaOH w roztworze, a powstawanie piku wydaje się zależeć od stężenia NaOH w roztworze (próbki 5-8, Tabela 3) (RRT = 0,79).Rysunek 5 przedstawia przykład chromatogramu jonowego, przedstawiający dwie próbki autoklawowane w obecności lub nieobecności NAOH.
Skróty: BDDE, eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu;LC-MS, chromatografia cieczowa i spektrometria masowa;MRM, monitorowanie wielu reakcji.
Uwaga: Górny chromatogram: Próbkę potraktowano 0,1% wodnym roztworem NaOH i autoklawowano (120°C przez 20 minut).Chromatogram dolny: Próbka nie była traktowana NaOH, ale autoklawowana w tych samych warunkach.Konwersję masy 203,30/129,10 Da (w dodatnim trybie MRM) analizowano metodą LC-MS.
Skróty: BDDE, eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu;LC-MS, chromatografia cieczowa i spektrometria masowa;MRM, monitorowanie wielu reakcji.
We wszystkich autoklawowanych próbkach, z lub bez NaOH, stężenie BDDE było znacznie zmniejszone (do 16,6 razy) (próbki 5-8, Tabela 2).Spadek stężenia BDDE może wynikać z faktu, że w wysokich temperaturach woda może działać jako zasada (nukleofil), otwierając pierścień epoksydowy BDDE, tworząc związek 1,2-diolowy.Jakość monoizotopowa tego związku różni się od jakości BDDE i dlatego nie zostanie naruszona.LC-MS wykrył przesunięcie masy o 203,30/129,10 Da.
Wreszcie, eksperymenty te pokazują, że generowanie nowych pików zależy od obecności BDDE, NAOH i procesu autoklawowania, ale nie ma nic wspólnego z HA.
Nowy pik znaleziony przy czasie retencji około 2,71 minuty następnie scharakteryzowano metodą LC-MS.W tym celu BDDE (9,9 mg/ml) inkubowano w 1% wodnym roztworze NaOH i autoklawowano.W Tabeli 4 charakterystykę nowego piku porównano ze znanym pikiem referencyjnym BDDE (czas retencji około 3,47 minuty).Na podstawie analizy fragmentacji jonów dwóch pików można wywnioskować, że pik o czasie retencji 2,72 minuty pokazuje te same fragmenty co pik BDDE, ale o różnej intensywności (Figura 6).Dla piku odpowiadającego czasowi retencji (PIS) 2,72 minuty bardziej intensywny pik zaobserwowano po fragmentacji przy masie 147 Da.Przy stężeniu BDDE (9,9 mg/ml) stosowanym w tym oznaczeniu, po rozdzieleniu chromatograficznym zaobserwowano również różne tryby absorbancji (UV, λ=200 nm) w widmie ultrafioletowym (Figura 7).Pik o czasie retencji 2,71 minuty jest nadal widoczny przy 200 nm, podczas gdy pik BDDE nie może być obserwowany na chromatogramie w tych samych warunkach.
Tabela 4 Wyniki charakteryzacji nowego piku o czasie retencji około 2,71 minuty oraz piku BDDE o czasie retencji 3,47 minuty
Uwaga: Aby uzyskać te wyniki, przeprowadzono analizy LC-MS i HPLC (MRM i PIS) na dwóch pikach.Do analizy HPLC stosuje się detekcję UV przy długości fali 200 nm.
Skróty: BDDE, eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu;HPLC, wysokosprawna chromatografia cieczowa;LC-MS, chromatografia cieczowa i spektrometria masowa;MRM, monitorowanie wielu reakcji;m/z, stosunek masy do ładunku;PIS, skanowanie jonowe produktu;światło ultrafioletowe, światło ultrafioletowe.
Uwaga: Fragmenty masowe uzyskuje się za pomocą analizy LC-MS (PIS).Górny chromatogram: widmo masowe fragmentów próbek wzorca BDDE.Chromatogram dolny: Widmo masowe wykrytego nowego piku (RRT związany z pikiem BDDE wynosi 0,79).BDDE poddano obróbce w 1% roztworze NaOH i autoklawowaniu.
Skróty: BDDE, eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu;LC-MS, chromatografia cieczowa i spektrometria masowa;MRM, monitorowanie wielu reakcji;PIS, skanowanie jonów produktu;RRT, względny czas retencji.
Rysunek 7 Chromatogram jonowy jonu prekursora 203,30 Da i (A) nowy pik z czasem retencji 2,71 minuty i (B) detekcja UV wzorcowego piku wzorcowego BDDE przy 3,46 minucie przy 200 nm.
We wszystkich wytworzonych usieciowanych hydrożelach HA zaobserwowano, że resztkowe stężenie BDDE po oznaczeniu ilościowym LC-MS wynosiło <2 ppm, ale w analizie pojawił się nowy nieznany pik.Ten nowy pik nie pasuje do standardowego produktu BDDE.Standardowy produkt BDDE został również poddany tej samej analizie konwersji jakości (konwersja MRM 203,30/129,10 Da) w trybie pozytywnego MRM.Ogólnie rzecz biorąc, inne metody analityczne, takie jak chromatografia, są stosowane jako testy graniczne do wykrywania BDDE w hydrożelach, ale maksymalna granica wykrywalności (LOD) jest nieco niższa niż 2 ppm.Z drugiej strony, jak dotąd, NMR i MS były wykorzystywane do charakteryzowania stopnia usieciowania i/lub modyfikacji HA we fragmentach jednostek cukru usieciowanych produktów HA.Celem tych technik nigdy nie było ilościowe określenie wykrywania resztkowego BDDE przy tak niskich stężeniach, jakie opisujemy w tym artykule (LOD naszej metody LC-MS = 10 ppb).
Czas publikacji: 01.09-2021